Zusammen bilden diese Histonmodifikationen den sogenannten Histoncode, der den Transkriptionszustand der lokalen Genomregion bestimmt.Untersuchung von Histonmodifikationen in einer bestimmten Region, oder über das Genom hinweg, können Geneaktivierungszustände, Positionen von Promotoren, Enhancern und anderen genregulierenden Elementen aufdecken.

Detaillierte Modifikationen von Histonen
 

Acetylierung

Die Acetylierung ist eine der am weitesten untersuchten Histonmodifikationen, da sie als eine der ersten entdeckt wurde, die die transkriptionelle Regulierung beeinflusst.Unmodifizierte Lysinrückstände sind positiv geladen, aber die Acetylierung führt zur Neutralisierung der Ladung auf Histonen, wodurch die Wechselwirkung von Histonen und negativ geladener DNA reduziert wird.Ermöglicht die Transkriptionsfaktorbindung und erhöht die Genexpression signifikant (Roth et al.., 2001).

Die Histonacetylierung ist an der Zellzyklusregulierung, der Zellproliferation und der Apoptose beteiligt und kann eine wichtige Rolle bei der Regulierung vieler anderer zellulärer Prozesse spielen, einschließlich der Zelldifferenzierung,DNA-Replikation und -reparaturEin Ungleichgewicht des Gleichgewichts der Histonacetylierung ist mit Tumorgenese und Krebsprogression verbunden.

Enzymatische Regulierung

Acetylgruppen werden den Lysinrückständen von Histonen H3 und H4 durch Histonen-Acetyltransferasen (HAT) hinzugefügt und durch Deacetylasen (HDAC) entfernt.bekannt als promotor-lokalisierte AcetylierungBeispielsweise ist die Acetylierung von K9 und K27 am Histon H3 (H3K9ac und H3K27ac) in der Regel mit Verstärkern und Förderern aktiver Gene verbunden.Niedrige Ebenen der globalen Acetylierung finden sich auch in transkribierten Genen., deren Funktion noch unklar ist.

Methylierung

Die Methylierung wird den Lysin- oder Argininrückständen der Histone H3 und H4 mit unterschiedlichen Auswirkungen auf die Transkription hinzugefügt.et al., 2012) während die Lysin-Methylierung je nach Methylierungsplatz sowohl bei der transkriptionellen Aktivierung als auch bei der Repression beteiligt ist.Diese Flexibilität kann dadurch erklärt werden, dass die Methylierung die Histonladung nicht verändert oder die Interaktionen zwischen Histon und DNA direkt beeinflusst., im Gegensatz zur Acetylierung.

Lysine können mono-, di- oder tri-methyliert sein, wodurch jede Methylierungsstelle eine weitere funktionale Vielfalt aufweist.sowohl die Mono- als auch die Tri-Methylierung auf K4 des Histons H3 (H3K4me1 und H3K4me3) sind Aktivierungsmarker, aber mit einzigartigen Nuancen: H3K4me1 markiert typischerweise Transkriptionsverstärker, während H3K4me3 Genpromotoren markiert.Tri-Methylierung von K36 (H3K36me3) ist ein Aktivierungsmarker, der mit transkribierten Regionen in Genkörpern assoziiert ist.

Im Gegensatz dazu sind Tri-Methylierung auf K9 und K27 des Histons H3 (H3K9me3 und H3K27me3) repressive Signale mit einzigartigen Funktionen:H3K27me3 ist ein vorübergehendes Signal an den Promoterregionen, das Entwicklungsregulatoren in embryonalen Stammzellen steuertIn der Zwischenzeit ist H3K9me3 ein permanentes Signal für die Heterochromatinbildung in genarmen Chromosomaregionen mit Tandem-Wiederholungsstrukturen, wie Satellitenwiederholungen,TelomereEs markiert auch Retrotransposonen und spezifische Familien von Zinkfingergenen (KRAB-ZFPs).mit H3K27me3 in intergenen und geschwiegenen kodierenden Regionen und H3K9me3 überwiegend in den kodierenden Regionen aktiver Gene.

Enzymatische Regulierung

Die Histonmethylierung ist ein stabiles Merkmal, das sich durch mehrere Zellteilungen ausbreitet und viele Jahre lang für irreversibel gehalten wurde.Es wurde kürzlich entdeckt, dass es sich um einen aktiv regulierten und reversiblen Prozess handelt.

Methylierung: Histonmethyltransferasen (HMT)

• Lysin

SET-Domain enthaltend (Histonschwanze)

Nicht-SET-Domänen enthaltend (Histonkerne)

• Arginin

PRMT-Familie (Protein-Arginin-Methyltransferasen)

Demethylierung: Histondemethylasen

• Lysin

KDM1/LSD1 (Lysin-spezifische Demethylase 1)

JmjC (Jumonji-Domain enthält)

• Arginin

PAD4/PADI4

Phosphorylierung

Die Histonphosphorylierung ist ein kritischer Zwischenschritt bei der Chromosomekondensation während der Zellteilung, der Transkriptionsregulation und der Reparatur von DNA-Schäden (Rossetto et al., 2012, Kschonsak et al.,2015 veröffentlicht)Im Gegensatz zu Acetylierung und Methylierung führt die Histonphosphorylierung zu Wechselwirkungen zwischen anderen Histonmodifikationen und dient als Plattform für Effektorproteine.Das führt zu einer Kaskade von Ereignissen.

Die Phosphorylierung erfolgt auf allen Kernhistonen mit unterschiedlichen Wirkungen auf jeden.sind an der Chromatinverdichtung und der Regulierung der Chromatinstruktur und -funktion während der Mitose beteiligtDiese sind wichtige Marker für den Zellzyklus und das Zellwachstum, die in allen Eukaryoten konserviert werden.Die Phosphorylierung von H2AX bei S139 (was zu γH2AX führt) dient als Rekrutierungspunkt für DNA-Schadensreparaturproteine (Lowndes et al.., 2005, Pinto et al., 2010) und ist eines der frühesten Ereignisse, die nach DNA-Doppelstrangbrüchen auftreten.Die H2B-Phosphorylierung ist nicht so gut untersucht, erleichtert aber die apoptosebedingte Chromatin-Kondensation., DNA-Fragmentierung und Zelltod (Füllgrabe et al., 2010).

Ubiquitalisation

Alle Histonkernproteine können ubiquityliert sein, aber H2A und H2B sind am häufigsten und zwei der am stärksten ubiquitylierten Proteine im Kern (Cao et al., 2012).Die Histon-Ubiquitylierung spielt eine zentrale Rolle bei der DNA-Schädenreaktion.

Die häufigste Form ist die monobikytylierte H2A auf K119 und H2B auf K123 (Hefe) /K120 (wirbelhafte Tiere).Monoubiquityliertes H2A ist auch mit Gen-Silencing verbunden, während H2B auch mit der Transkriptionsaktivierung assoziiert ist.

Poly-Ubiquitylation ist seltener, aber auch wichtig bei der DNA-Reparatur-- Polyubiquitylation von H2A und H2AX auf K63 bietet eine Erkennungsstelle für DNA-Reparaturproteine, wie RAP80.

Enzymatische Regulierung

Wie bei anderen Histonmodifikationen ist die Monobikytylierung von H2A und H2B reversibel und wird durch Histon-Ubiquitin-Ligasen und deubiquitylierende Enzyme streng reguliert.

Monobikytylierung

• H2A: Polycomb-Gruppenproteine
• H2B: Bre1 (Hefe) und seine Homologen RNF20/RNF40 (Säugetiere)

Polyubiquitulation

• H2A/H2AX K63: RNF8/RNF168
   

Schnelle Anleitung zu Histonmodifikationen

Tabelle 1. Ein Cheat-Sheet für die häufigsten Histonmodifikationen undwo sie zu finden sind:

Untersuchung von Histonmodifikationen durch ChIP

ChIP verwendet Antikörper zur Isolierung eines interessierten Proteins oder einer Modifikation zusammen mit der DNA, an die es gebunden ist (Abbildung 5).Die DNA wird dann sequenziert und dem Genom zugeordnet, um den Standort und die Häufigkeit des Proteins oder der Modifikation zu ermitteln..

Abbildung 2: Histonmodifikation

Immunprecipitation und DNA-Reinigung ermöglichen die Isolierung und Identifizierung der genomischen Regionen, die die Modifikationen besetzen.

Die Verwendung von Antikörpern gegen spezifische Histone und Histonmodifikationen in ChIP-Experimenten kann die spezifischen Standorte von

• Höhere Chromatinstrukturen, z. B. H3K9me3-Markierungen, Heterochromatin und Satellitenwiederholungen
• Aktive oder verstummte Gene und genetische Programme, z. B. AH3K9ac markiert die Genaktivierung
• Genetische Elemente wie Promotoren und Enhancer, z.B. H3K27me3 markiert Promotoren in genreichen Regionen, H3K4me1 markiert aktive Enhancer

Wenn die Funktion einer Histonmodifikation bekannt ist, kann ChIP spezifische Gene und Regionen mit dieser Histonmodifikationssignatur und der entsprechenden Funktion im gesamten Genom identifizieren.Diese Gene und Regionen können dann auf ihre Rolle im biologischen Prozess von Interesse weiter untersucht werden.Die Verwendung von ChIP gegen H3K4me1 wird beispielsweise den Standort und die Sequenz der aktiven Enhancer im gesamten Genom aufdecken und auf Gene und genetische Programme von Interesse hinweisen.

Alternativ, wenn die Funktion der Histonmodifikation nicht bekannt ist, kann ChIP Sequenzen, Gene und Standorte mit dieser Signatur identifizieren,die dann verwendet werden kann, um die Funktion der Modifikation abzuleitenDiese Technik war entscheidend für die Entschlüsselung eines Großteils des Histoncodes und ist immer noch wertvoll, um die Funktion neu entdeckter Modifikationen wie Ubiquitylation und andere neuartige Markierungen zu ermitteln.

Histonmodifizierende Enzyme: Schreiber und Löscher
- Ich weiß.

Histonmodifikationen werden durch spezifische Enzyme dynamisch hinzugefügt und aus den Histonproteinen entfernt (Tabelle 2). Das Gleichgewicht zwischen diesen Schreibern und Löschern bestimmt, welche Markierungen auf Histonen vorhanden sind,und auf welchen Ebenen, um letztendlich zu kontrollieren, ob bestimmte genetische Programme und die zellulären Prozesse, die sie orchestrieren, eingeschaltet oder ausgeschaltet werden.

Tabelle 2. Die wichtigsten Kategorien von Histonenschreibern und -radiern:

Die Identifizierung von Modifikationswegen und der spezifischen Schreiber und Löscher kann aufzeigen:

• Relevante zelluläre Wege, genetische Programme und physiologische Wirkungen für weitere Untersuchungen.Beispielsweise aktivieren Histonen-Deacetylasen (HDACs) Immunentwicklungswege, während Histonen-Acetyltransferasen (HATs) bei der Differenzierung und Proliferation eine entscheidende Rolle spielen.
• Ungleichgewichte zwischen Schriftstellern und Löschern, die die genetische Programmierung verändern und Krankheitsprozessen verursachen.Die Charakterisierung solcher Ungleichgewichte und der spezifischen Enzyme, die beteiligt sind, kann Einblicke in die Krankheitspathologie von Krebs bis hin zu Autoimmunerkrankungen geben.
• Neue Arzneimittelziele und Therapiestrategien.Wenn ein Ungleichgewicht festgestellt wird, können Medikamente entwickelt werden, die die Aktivität dieser Enzyme beeinflussen und das Ungleichgewicht korrigieren.neue Therapiestrategien gegen Krankheiten anbieten, die bisher den medizinischen Bemühungen entgangen sindZum Beispiel werden viele HDAC-Hemmer als neuartige Medikamente gegen Krebs und entzündliche Erkrankungen wie Arthritis und Typ-I-Diabetes entwickelt.

Für die Entwicklung von Arzneimitteln können Verbindungen leicht auf ihre Wirkung auf die Aktivität von Schreiber und Löscher untersucht werden.

Charakterisierende Methylierungswege von Histonen

Im Allgemeinen sind Histonmethyltransferase-Assays (HMT) schwierig zu entwickeln, und die meisten haben aufgrund des Assay-Designs mehrere Nachteile.3H-SAM als Methylspender und S-Adenosylhomocystein (SAH) als allgemeines Nebenprodukt der Methylierung.

• Umgang mit radioaktivem Material
• Hohe Empfindlichkeit gegen niedrige k_Katze(Umsatz in der Regel < 1 min-1) und K_MWerte für den Methylspender, SAM
• Vorläufige Reinigung von Enzym-/Proteinkomplexen zur Bewertung der Aktivität spezifischer HMTs

Abcam HMT-Aktivitätsanalysen überwinden diese Schwierigkeiten, indem sie die Aktivität spezifischer HMTs mit Antikörpern beurteilen, die das spezifische methylierte Produkt erkennen, und Folgendes vorsehen:

• Einfache kolorimetrische oder fluorometrische Nachweisung ohne Radioaktivität
• Kompatibilität mit Kernextrakten oder gereinigten Proteinen (Analyse ist spezifisch für die untersuchte Modifikation)
• Daten in 3 Stunden

Charakterisierung der Demethylase-Aktivität

Histondemethylase-Aktivitätstests messen typischerweise die Bildung von Formaldehyd, einem Nebenprodukt der Demethylierung.Thiolgruppen und eine Reihe von IonenÄhnlich wie bei den Methylierungstests sind diese nicht spezifisch für eine Demethylase und können nur mit gereinigtem Protein durchgeführt werden.

Die Abcam-Histondemethylase-Analysen umgehen diese Probleme, indem sie direkt die Bildung des demethylierten Produkts messen und Folgendes vorsehen:

• Erhöhte Empfindlichkeit (20-1000-fache) gegenüber Formaldehyd-basierten Analysen
• Genaue Daten ohne Beeinträchtigung durch Thiole, Reinigungsmittel oder Ionen
• Kompatibilität mit Kernextrakten oder gereinigtem Protein (aufgrund der Spezifität des Tests für die von Interesse gewordene Änderung)
• Messen der Demethylase-Aktivität bei einer Vielzahl von Arten, einschließlich Säugetierzellen/Geweben, Pflanzen und Bakterien
• Schnelles Mikroplattenformat mit einfachen kolorimetrischen oder fluorometrischen Ablesungen
• Daten in 3 Stunden

Charakterisierende Histonacetylierungswege

Abcam bietet Kits zur Analyse der HAT-Aktivität insgesamt sowie der H4-spezifischen HAT-Aktivität.das das acetylierte Peptid und CoA-SH erzeugtDas CoA-SH-Nebenprodukt wird anschließend durch kolorimetrische oder fluorometrische Methoden gemessen:

• Colorimetrische Untersuchungen- CoA-SH dient als wesentliches Coenzym für die Produktion von NADH, das mit einem löslichen Tetrazoliumfarbstoff reagiert, um ein Produkt zu erzeugen, das spektrophotometrisch nachgewiesen werden kann.Dieser Test ist ideal für kinetische Studien geeignet., mit kontinuierlicher Detektion.
• Fluorometrische Untersuchungen- CoA-SH reagiert mit einem Entwickler und einer Sonde, um ein Produkt zu erzeugen, das fluorometrisch erkannt wird.

Charakterisierung der Aktivität von Histondeacetylase

HDAC-Proteine werden nach Funktion und DNA-Sequenzähnlichkeit in vier Hauptgruppen eingeteilt (Klasse I, IIA, IIB, III, IV).und IIB gelten als "klassische" HDACs, deren Aktivität durch Trichostatin A (TSA) gehemmt wird., während Klasse III eine Familie von NAD ist+Die Klasse IV gilt als eigenständige atypische Klasse und basiert ausschließlich auf der Ähnlichkeit der DNA-Sequenz mit den anderen.

Jede dieser Klassen ist mit verschiedenen zellulären Programmen verbunden und kann individuell mit verschiedenen fluorometrischen Analysen untersucht werden.SIRT sind typischerweise mit Krebs und neurologischen Erkrankungen verbundenDie Erkennung der SIRT-Aktivität oder die Identifizierung von Medikamenten, die die SIRT-Aktivität beeinflussen, kann auf neue Diagnostik- oder Therapiestrategien für diese Krankheiten hinweisen.

Fluorometrische Untersuchungen verwenden ein acetyliertes Peptidsubstrat mit einem Fluorophore und einem Dämpfer an seinen Amino- und Carboxylterminalen.Freisetzung des Fluorophors aus dem LöscherDie anschließende Erhöhung der Fluoreszenzintensivität des Fluorophors ist direkt proportional zur Deacetylase-Aktivität.

Hemmende Schreiber und Löscher

Es kann nützlich sein, diese modifizierenden Enzyme mit kleinen Molekülen zu hemmen und dann nachgelagerte Folgen zu bewerten, um die Beteiligung und biologische Funktion von Histonmodifikationen zu untersuchen.Schreiber- und Löschmittelhemmer sind entscheidende Instrumente, um die Rolle der epigenetischen Modifikationswege zu verstehen.Sie sind zudem für die Validierung von "drugable"-Zielen im Rahmen von präklinischen Studien sowohl in akademischen als auch in industriellen Kontexten von wesentlicher Bedeutung.

Histon-Modifikationsleser/Übersetzer

Histonmodifikationen regulieren die physikalischen Eigenschaften von Chromatin und seinen entsprechenden Transkriptionszustand.entweder direkt (z. B. Acetylgruppen, die negativ geladene DNA abstoßen, um eine offene Chromatinkonformation zu erzeugen) oder über Proteinaadapter, sogenannte EffektorenEffektorproteine erkennen und binden an spezifische epigenetische Markierungen und rekrutieren anschließend molekulare Maschinen, um die Chromatinstruktur zu verändern.Diese epigenetischen Lesegeräte bestimmen das Funktionsergebnis von Histon-Modifikationen, indem sie den Histon-Code in Aktion umsetzen.

Effektor-Domänen erkennen spezifische Histonmodifikationen

Effektorproteine erkennen und binden sich an Histonmodifikationsmarken durch Effektordomänen, die als Module bekannt sind (Tabelle 3).

Diese Module erkennen spezifische Histonmodifikationen mit Aminosäuren, die die Modulbindungsscheibe auskleben.Rückstände außerhalb dieser Bindemasse (insbesondere in den Positionen N+2 und N-2) bestimmen die Spezifität des zu modifizierenden Histon- und Aminosäureresids (z. B. H3K4 vs. H4K20).

Kleine Abweichungen in den Rückständen innerhalb oder außerhalb der Bindemasse ermöglichen die Erkennung ähnlicher epigenetischer Markierungen.oder Tri-Methylierungszustände mit leichten Veränderungen der Struktur des MethylbindungsmodulsZum Beispiel können Tudor-Domänen ausschließlich di- oder tri-methylierte Lysine binden, während PHD-Fingermodule sich an beide oder nur an unveränderte Lysine binden können (Ruthenburg et al., 2007).

Multivalenz ermöglicht die Komplexität des Histoncodes

In demselben Protein und/oder Proteinkomplex finden sich häufig mehrere Histonbindungsmodule, die die Erkennung spezifischer Kombinationen von Histonmodifikationen ermöglichen.Dies ermöglicht einen komplexeren Histoncode, wo Histonmodifikationen miteinander interagieren, anstatt isoliert interpretiert zu werden.

Die Multivalente Einbindung von Histonmodifikationen ist wichtig für die Erkennung diskreter Markierungsmuster mit zusammengesetzter Spezifität und erhöhtem Affinität.Gleichzeitig ermöglichen sie vielfältige und präzise nachgelagerte Maßnahmen.Zum Beispiel kann ein einzelnes epigenetisches Markenzeichen (wie H3K4me3) die Gentranskription in einem Kontext aktivieren, aber in einem anderen, abhängig von den umgebenden Marken, unterdrücken.Tabelle 4 zeigt Beispiele für einige der funktionalen Assoziationen verschiedener Kombinationen von Histonmodifikationen (Ruthenburg et al.., 2007).

Tabelle 4. Funktionale Zusammenhänge von histonischen und DNA-Modifikationen:

Mehrere Effektormodule in einem Protein oder Komplex können mit Histonmodifikationen auf den gleichen oder über die Histone und/oder Nukleosomen hinweg interagieren. Diese Interaktionen können wie folgt kategorisiert werden:

Intranukleosomal:Bindung an das gleiche Nukleosom

• Cis-Histon: Bindung an denselben Histonschwanz
• Trans-Histon: Bindung an verschiedene Histonschwanze

Internukleosomal:Bindung an verschiedene Nukleosomen

• Nebenbrücken: Bindung an angrenzende Nukleosomen
• Diskontinuierliche Brückenbildung: Bindung an nicht benachbarte Nukleosomen

Referenzen

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Ruthenburg, A.J., Li, H., Taverna, S.D., Patel, D.J. & Allis, C.D. Multivalente Einbindung von Chromatinmodifikationen durch verknüpfte Bindemodule.

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