Cryo-EM kann zur Bestimmung der Strukturen großer molekularer Komplexe wie des Ursprungserkennungskomplexes (ORC) verwendet werden.Das ORC erkennt und bindet DNA an, um den Prozess zu starten, der das genetische Material der Zelle vor der Zellteilung kopiertKredit: Huilin Li vom Brookhaven National Laboratory und Bruce Stillman vom Cold Spring Harbor Laboratory.

Was ist Kryo-EM, und wie funktioniert es?

Bei der Kryo-EM werden Zellen, Viren, molekulare Komplexe oder andere Strukturen schnell eingefroren, so daß Wassermoleküle keine Zeit haben, Kristalle zu bilden.Wissenschaftler benutzen ein Elektronenmikroskop, um die gefrorene Probe mit einem Elektronenstrahl zu sprengenDies erzeugt eine zweidimensionale Projektion der Probe auf einem digitalen Detektor.Durch die Erstellung von Hunderten von Projektionen der Probe aus vielen verschiedenen Winkeln und dann den Durchschnitt dieser WinkelDie jüngsten Fortschritte in der Kryo-EM liefern sehr detaillierte Bilder von Proteinen und anderen biologischen Strukturen.einschließlich größerer Strukturen wie RNA-Protein-Komplexe.

Einführung der Kryogenen Elektronenmikroskopie (Cryo-EM):

In den vergangenen zehn Jahren hat die kryogene Elektronenmikroskopie (Kryomikroskopie) zunehmend die traditionellen Methoden der Probenvorbereitung für die Elektronenmikroskopie ersetzt.Es war die Pionierarbeit von Taylor und Glaeser und von Dubochet und Kollegen, die den Weg für diese Entwicklung ebnete., die einen Quantensprung der biologischen Elektronenmikroskopie darstellte, da sie es ermöglichte, Bilder von voll hydratisierten Proben in einem nahezu natürlichen Zustand zu erhalten.

Der Begriff Kryo-EM bezieht sich auf verschiedene Transmissions-Mikroskopieverfahren, wenn sie auf in Glasis eingebettete Proben angewendet werden.Drei Hauptzweige der Kryo-EM sind im Zusammenhang mit der molekularen Strukturbiologie relevant: Elektronenkristallographie, Einzelteilchenanalyse und Elektrontomographie.

Die Elektronenkristallographie bietet den Vorteil bei der Bestimmung der Struktur von Proteinen, die 2D-Kristalle unter 4Å bilden (z. B. wie bei wassertransportierenden Membranproteinen - Aquaporinen gezeigt).Membranproteine sind besonders vielversprechende Kandidaten für die Bildung von 2D-Kristallen- Auflösungen von mehr als 2 Å wurden erzielt. three dimensional electron crystallography of protein microcrystals (microED) has been developed and is showing promises in solving high resolutions structures of proteins forming tiny 3D-crystals (200 nm) usually not amenable for study by x-ray crystallography.

Die Einzelpartikelanalyse wird für isolierte und gereinigte größere Ansammlungen mehrerer Untereinheiten verwendet, die oft sehr heterogen, metastabil und extrem schwer zu kristallisieren sind (z. B.das Ribosom oder das 26S-Proteasom) bei einer Routineauflösung von 310 Å und im besten Fall unter 2 ÅProbengrößenbereich: 5 bis 150 nm.

Was ist Röntgenkristallographie und wie funktioniert sie?

Die Röntgenkristallographie schießt einen Strahl von Röntgenstrahlen durch einen winzigen festen Kristall, der aus Billionen identischer Proteinmoleküle besteht.ähnlich wie Bilder in einer Digitalkamera aufgenommen werdenEin Computer misst die Intensität der zerstreuten Röntgenstrahlen, um jedem Atom im kristallisierten Molekül eine Position zuzuweisen.Diese Methode wurde verwendet, um mehr als 85 Prozent der bekannten Proteinstrukturen zu bestimmen.

Einige Details über Röntgen-Kristallographie und Kryo-EM:

1Kleine Proteine eignen sich besser für die Röntgenkristallographie, da sie mit der Kryo-EM schwer zu erkennen sein können.

2Die Röntgenkristallographie kann sehr hohe Auflösungen erzielen, obwohl in den letzten Jahren mit der Kryo-EM vergleichbare Ergebnisse erzielt wurden.

3Es kann schwierig sein, große Strukturen, Komplexe und Membranproteine zu kristallisieren.

4. EM (negative Färbung) bietet eine schnelle Untersuchung der Proben, um Aggregation auszuschließen und Oligomerisierung zu bestimmen, wodurch ein visueller Überblick darüber gegeben wird, wie sich die Probe verhält und was sie enthält.

5. Bei der Kryo-EM werden weniger Proteine benötigt als bei der Röntgenkristallographie.Diese Methode könnte Proben mit einer Proteinmenge von weniger als 2 mg (< 5-10 mg/ml) zugute kommen.*

KS-V-Peptid-Krio-EMDienstleistungsplattform:

• Negative Färbungsscreening und Berechnung der 2D-Klassifizierung
• Vorbereitung von gefrorenen Rasterproben und Zustandsscreening
• Datenerhebung in hoher Auflösung und 3D-Rekonstruktion, Modellierung